PCR oligo 디자인은 왜 까다로울까

PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)은 DNA 시퀀스를 매우 빠르고 효율적으로 복제하는 기술입니다. 이 기술은 분자생물학, 유전학, 생물학 연구, 의학, 법의학, 진단 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용됩니다. 

PCR의 기본적인 동작 원리는

 

1. 변성(Denaturation): PCR 반응은 DNA 이중나선을 개별적인 단일 가닥으로 분리하는 고온 단계로 시작합니다. 일반적으로 94-98°C에서 수행됩니다.

 

2. 결합(Annealing): 온도를 낮춰 특정 DNA 시퀀스에 맞춰 설계된 짧은 DNA 조각인 프라이머가 단일 가닥 DNA에 결합할 수 있도록 합니다. 이 온도는 프라이머의 melting 온도에 따라 달라질 수 있습니다.

3. 연장(Extension): DNA 중합효소가 작용하여 각 DNA 가닥의 나머지 부분을 합성합니다. 이 과정은 일반적으로 72°C에서 수행됩니다. 중합효소는 프라이머가 결합한 지점에서 시작하여 새로운 DNA 가닥을 합성합니다.

이 세 단계는 여러 번 반복되어, 목표 DNA 시퀀스의 수백만 복사본을 생성할 수 있습니다. PCR은 DNA 샘플의 극소량으로도 충분하며, 이는 병원균 검출, 유전적 변이 분석, 고대 DNA 연구, 법의학적 샘플 분석, 유전자 클로닝 및 많은 분야에 사용됩니다. 

 

 

PCR (Polymerase Chain Reaction)에서 "올리고"는 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"를 의미합니다. 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA의 짧은 단편으로, 특정 DNA 시퀀스의 합성에 사용됩니다. PCR에서 올리고는 주로 "프라이머(primer)"로 사용되며, 아래와 같은 역할을 합니다.
1. 타겟 시퀀스의 결정: 프라이머는 PCR 반응에서 복제될 특정 DNA 영역을 결정합니다. 프라이머는 그 특정 DNA 시퀀스와 상보적인 염기 서열을 가지고 있어, DNA 템플릿에 특이적으로 결합합니다.
2. DNA 중합효소의 시작점 제공: DNA 중합효소는 프라이머가 결합한 지점에서 DNA 합성을 시작합니다. 중합효소는 프라이머의 3'-OH 그룹에서 새로운 DNA 가닥을 연장합니다.

PCR에서는 보통 두 개의 프라이머가 사용됩니다. 하나는 타겟 DNA의 한 가닥에, 다른 하나는 반대 가닥에 결합합니다. 이렇게 함으로써, PCR 과정에서 DNA의 특정 영역이 효율적으로 복제될 수 있습니다. 프라이머의 디자인은 PCR에 있어 매우 중요하며, 특이성, melting temperature, 염기 구성 등 여러 요인을 고려하여 디자인됩니다. 

 

 

그렇다면 PCR (Polymerase Chain Reaction) 올리고(oligo) 디자인이 까다로운 이유는 무엇일까요?

- 특이성(Specificity): PCR 올리고는 타겟 DNA 시퀀스에만 특이적으로 결합해야 합니다. 잘못된 시퀀스에 결합하면 비특이적 증폭이 발생할 수 있어, 디자인 시에는 유사한 시퀀스와의 구별이 중요합니다.

- 멜팅 온도(Melting Temperature, Tm): 두 올리고의 멜팅 온도가 비슷해야 합니다. 이는 PCR 반응 중에 두 올리고가 동시에 타겟 DNA에 결합하도록 하기 위함입니다. 멜팅 온도가 서로 다르면, 한 쪽이 더 빨리 또는 늦게 결합해 비효율적인 증폭을 초래할 수 있습니다. 멜팅 온도를 결정 짓는 요인에는 다양한 것들이 있지만 이 글에서는 생략하고 다음에 더 깊이 다뤄보도록 하겠습니다. 

- 염기 구성(Base Composition): GC 함량이 높으면 멜팅 온도가 높아집니다. 그러나 너무 높은 GC 함량은 올리고가 자체적으로 구조를 형성할 수 있어, 이러한 secondary structure는 증폭 효율을 감소시킬 수 있습니다.

- 길이: 올리고의 길이도 중요합니다. 너무 짧으면 특이성이 떨어질 수 있고, 너무 길면 제조가 어렵고, secondary structure 형성 가능성이 높아집니다.

- 반복되는 시퀀스와 secondary structure: 연속된 같은 염기나 간단한 반복 시퀀스는 비특이적 결합을 증가시킬 수 있습니다. 또한, 올리고 내에서 stem-loop 같은 secondary structure가 형성되면 결합을 방해할 수 있습니다.

- 3' 끝 처리: 올리고의 3' 끝은 중요한데, 이 부분이 타겟 DNA에 잘못 결합하면 연장 반응이 일어나지 않을 수 있습니다. 

이러한 다양한 요소들을 고려하여 올리고를 설계하는 것이 중요하기에 올리고 디자인은 꽤나 복잡합니다. 그러기에 디자인 과정에서는 컴퓨터 프로그램을 사용해 이러한 변수들을 최적화하는 것이 일반적으로 행해지고 있습니다.